3.1 益生菌菌株选择和制剂标准
建立益生菌选择标准和评价规程对微生态产业的有序和规范化发展十分重要。我国至今少有建立益生菌的标准,更没有建立评价规程。欧盟评价益生菌标准的规程见图1。
理想的益生菌应具备如下特性和安全标准(EFSA,2005):
⑴菌株没有毒性和病原性;
⑵菌株应有准确的分类鉴定;
⑶目标菌株能在消化道栖息;
⑷所选菌株能够在消化道的目标位置存活、定植和产生代谢活性(如产生消化酶、有机酸等),能够耐过胃液和胆汁、在胃肠道留存、粘附到肠上皮细胞或肠绒毛、能与常驻菌群竞争;
⑸菌株能够产生抗菌物质;
⑹菌株能够与病原菌拮抗;
⑺菌株能够调控免疫反应;
⑻菌株具有遗传稳定性;
⑼益生菌制剂能发挥至少一种有确实科学依据支持的促进健康作用(减少毒胺、中和内毒素等);
⑽制剂在加工、贮藏和运输过程中,菌株具有良好的可控性,其特性具有良好的稳定性;⑾制剂有良好的活性,包括菌株活性、代谢产物活性;⑿制剂在工业加工过程中,具有理想的风味和工艺特性。
相比之下,我国在益生菌筛选方面,相对粗糙和差距较大,特别是在上述⑴、⑷、⑻、⑼、⑿项目上缺乏科学扎实的研究。
3.2 欧盟和FAO/WHO的益生菌评价规程
欧洲联合会基金项目“人用益生乳酸菌的生物安全评价”(PROSAFE)的目标是提出基于安全性评估证据基础上的人用益生菌的推荐规范。
这个项目的结论在2006年一次研讨会上提出建议:
①分子的方法,如核糖体DNA测序,在非常权威和专业的实验室进行,进行准确的分类。此外,益生菌菌株应存入公共菌种保藏中心。
②对抗生素有抗性的非野生型(或人工改造)微生物未经过恰当的风险评估,不应该作为未来人或动物的产品开发。
③应避免使用肠球菌(如粪肠球菌等)或其它有毒性基因的乳酸菌。其他特性,包括胆汁酸脱抱合作用、黏附细胞作用和与毒性无关的细胞外基质蛋白以及益生菌在体外结肠的模型中存活都认为与生物安全评估无关。
④除了体内安全评估准则外,通过随机的、安慰剂对照和双盲设计研究在人类的定植情况,但这样研究的细节并不是特定的。
⑤运用动物模型来测定安全性是很有争议的。然而,实验性心内膜炎大鼠模型被认为是最可靠的动物模型。
FAO/WHO 在2002也建立了一套与欧共体类似的安全性评估指导规则。要点如下:
①建立传统产品的安全使用历史;
②不能存在抗生素耐药性转移的风险;
③不能出现毒性风险;
④要评估某种特定的代谢活性,如D-乳酸盐生产、胆汁盐脱抱合;
⑤如果某菌株是一种已知的哺乳动物毒素生产者,需要测试毒素生产情况和安全性;
⑥如果某菌株是具有已知的溶血潜能,就应测定其溶血活性;
⑦评估产品有无副作用;
⑧产品销售市场后,对消费者使用后出现的各种不良事件,应进行流行病学监测。
3.3 理想的益生菌菌株选育应遵从特异性和多样性原则
产品开发者和使用者都要注意菌株的特异性,即同名的不同菌株的生物学特性会有较大差异性,而且其所发挥的作用或功效也是不同的,具有株、种、属的特异性(差异性)。这种差别表现在多方面,如生长快慢、抗逆性(抗酸、碱、胆盐、热等)、产酸特性、死亡菌体对大肠杆菌或沙门氏杆菌等病原菌的抗黏附性、产酶特性(动物和微生物都可以产生的消化酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等,只有某些(不是所有)微生物能产生非淀粉多糖酶、纤维素酶等)、是否产生抗菌物质、是否对生产性能(如饲料转化效率、肉蛋奶产量等)有正效应、是否具有免疫刺激特性以及加工和储运特性等。对有条件的企业,还应该对所选的优秀菌株进行全基因组测序,通过功能基因组学进一步了解所选菌株的生物学特性,作者课题组2014年完成了益生芽孢杆菌LFB112的全基因组测序,这也是我国第一株测序的益生芽孢杆菌,在GenBank中的登录为CP006952,从基因组信息获知该菌的185个代谢途径产生7种抗菌物质以及产生多种酶、有机酸、维生素、调节免疫等多种信息。希望生产企业深入筛选菌种,使用者认真选择产品。
我国目前市场上许多益生菌产品中所用菌株的特异性和多样性不明显。农业部2013年公布了我国允许添加的微生物种类有34种,但在各类益生菌产品中实际所用的菌种最多的是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌、酿酒酵母,其次是嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母、乳酸片球菌、戊糖片球菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、丁酸梭菌,目前还没有一种产品含有双歧杆菌。长期过度、过多、过集中地使用某几种益生菌有可能导致使用效果(功效)降低,而且破坏大生态的微生物平衡。自然生态界遵循多样性原则,即多样性越丰富,生态环境越稳定、越健康。因此,呼吁开发和生产益生菌的企业应尽量增加益生菌的多样性。